结直肠癌作为全球发病率和死亡率均位居前三的消化系统恶性肿瘤，其高复发转移特性是导致患者预后不佳的核心难题。
临床治疗中，手术、化疗等传统手段虽能控制局部病灶，但易引发肠道功能损伤、耐药性等副作用，且难以有效阻止癌细胞远端转移 —— 而转移正是结直肠癌患者死亡的主要原因。从分子机制来看，上皮间充质转化（EMT）是癌细胞获得迁移侵袭能力的关键过程，其与 Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活密切相关，该通路的失控会促使 β- 连环蛋白（β-catenin）在细胞核内蓄积，进而激活下游靶基因，推动 EMT 进程与肿瘤进展，成为结直肠癌治疗的重要靶点。
在中医药抗肿瘤研究中，桑黄作为《神农本草经》记载的 “森林黄金”，因兼具低毒性与多靶点作用优势，已被证实对多种肿瘤具有抑制效果。发表于安徽医科大学硕士学位论文的《药用真菌桑黄通过抑制 Wnt/β-catenin 信号通路和 EMT 阻止结直肠癌侵袭转移》，通过体内外实验系统探究了桑黄总提取物（TES）对结直肠癌细胞增殖、迁移侵袭的干预作用及分子机制，为天然药物防治结直肠癌转移提供了新的实验依据与理论支撑。
实验概述
本研究以桑黄（Sanghuangporus vaninii）为研究对象，采用超声回流提取结合冷冻干燥技术制备总提取物（TES），以人结直肠癌细胞株 HCT 116、DLD-1 及 BALB/c 裸鼠皮下移植瘤模型为研究载体，围绕 “细胞增殖 - 周期 - 克隆形成 - 迁移侵袭 - 体内成瘤” 关键环节，结合 Western Blot、Transwell、流式细胞术等技术，验证 TES 对结直肠癌的抑制效果；进一步聚焦 Wnt/β-catenin 信号通路与上皮间充质转化（EMT），揭示 TES 阻止结直肠癌侵袭转移的分子机制。实验分为体外细胞实验（增殖抑制、周期阻滞、迁移侵袭、蛋白表达检测）和体内动物实验（裸鼠皮下瘤模型、抑瘤率计算、病理分析）两部分，明确 TES 的作用靶点及通路调控关系。
实验方法
1. 桑黄总提取物（TES）制备
· 称取 300 g 桑黄饮片，剪碎后分两步提取：先用 3 L 95% 乙醇 60℃回流提取 3 h（重复 3 次），收集乙醇提取液；残渣再用 3 L 超纯水 100℃超声提取 3 h（1 次），收集水提取液；合并两种提取液，浓缩后冷冻干燥，得到 TES，于 - 20℃保存备用，最终提取率为 8.5%。
2. 细胞培养与分组
· 细胞培养：HCT 116 细胞用含 10% 胎牛血清（FBS）的 McCoy's 5A 培养基，DLD-1 细胞用含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基，均在 37℃、5% CO₂培养箱中培养，传至第 2 代对数生长期用于实验。
· 浓度筛选与分组：通过 CCK-8 法检测 0、20、40、80、160、320、640 μg/mL TES 对细胞增殖的影响，计算 IC₅₀值（HCT 116 为 53.2±2.3 μg/mL，DLD-1 为 95.0±5.1 μg/mL）；后续实验设置浓度梯度：HCT 116 为 0、12.5、25、50 μg/mL，DLD-1 为 0、25、50、100 μg/mL，同时设空白对照组、阳性药物组（5 - 氟尿嘧啶，5-FU）。
3. 体外细胞实验检测指标与方法
（1）细胞增殖与形态观察
· CCK-8 法：将 5×10³ 个细胞 / 孔接种于 96 孔板，加不同浓度 TES 培养 48 h，加入 10 μL CCK-8 溶液孵育 1.5 h，检测 450 nm 处 OD 值，计算增殖抑制率。
· 形态观察：1×10⁵个细胞 / 孔接种于 6 孔板，加药培养 48 h 后，光学显微镜下观察细胞形态变化并拍照。
（2）细胞周期与克隆形成
· 流式细胞术（PI 染色）：3-4×10⁵个细胞 / 瓶接种于 T25 瓶，加药培养 48 h 后，胰酶消化收集细胞，预冷无水乙醇固定 4 h，PI 染料避光孵育 30-60 min，流式细胞仪检测周期分布（G0/G1、S、G2/M 期），Modfit LT 5.0 软件分析。
· 平板克隆形成：500 个细胞 / 孔接种于 6 孔板，加药培养 48 h 后换新鲜培养基，继续培养 7 d（每 2 天换液），4% 多聚甲醛固定、0.1% 结晶紫染色，Image J 计数克隆数。
（3）细胞迁移与侵袭（Transwell 实验）
· 迁移实验：下室加 500 μL 含 10% FBS 的培养基（含对应浓度 TES），上室加 200 μL 无血清培养基（含 1×10³ 个细胞 + 对应浓度 TES），培养 48 h 后，4% 多聚甲醛固定、结晶紫染色，显微镜下计数穿膜细胞。
· 侵袭实验：提前在 Transwell 小室铺 1:8 稀释的 Matrigel 基质胶（37℃孵育 3 h 凝固），后续步骤同迁移实验，模拟细胞外基质（ECM）环境检测侵袭能力。
（4）蛋白表达检测（Western Blot）
· 提取 HCT 116 细胞总蛋白（RIPA 裂解液 + 蛋白酶 / 磷酸酶抑制剂），BCA 法定量后变性处理；通过 SDS-PAGE 电泳、湿法转膜（PVDF 膜）、5% 脱脂牛奶封闭、一抗孵育（4℃过夜）、二抗孵育（室温 1 h）、ECL 显影，检测关键蛋白：
o 迁移侵袭相关：MMP2、MMP9；
o EMT 相关：E-Cadherin（上皮标志物）、N-Cadherin（间质标志物）、Snail（EMT 转录因子）；
o Wnt/β-catenin 通路相关：Wnt3a、β-catenin、APC、c-Myc、Cyclin D1、MMP7。
4. 体内动物实验
· 裸鼠皮下瘤模型构建：30 只 BALB/c 裸鼠（3-4 周龄，雄性）右前肢皮下接种 100 μL 含 1.5×10⁶个 HCT 116 细胞的 PBS 悬液，待瘤体积达 50-100 mm³ 时随机分 5 组（n=6）：
o 模型组：灌胃生理盐水；
o 阳性药物组：腹腔注射 5-FU（10 mg/kg，每 2 天 1 次）；
o TES 低 / 中 / 高剂量组：灌胃 TES（400、800、1200 mg/kg，每日 1 次）；
· 指标检测：每 2 天测瘤体长度（L）、宽度（W），按公式 V=π×L×W²/6 计算体积；给药 20 天后处死裸鼠，剥离瘤体称重，计算抑瘤率（%）=（模型组瘤重 - 给药组瘤重）/ 模型组瘤重 ×100%；瘤组织 HE 染色观察病理变化。
5. 统计分析
采用 SPSS 25.0 软件，数据以xˉ±s表示，多组比较用 One-Way ANOVA，P<0.05为差异有统计学意义；GraphPad Prism 9.0 绘制生存曲线、肿瘤生长曲线。
实验结果
1. TES 对结直肠癌细胞增殖的抑制作用
· 增殖抑制：TES 对 HCT 116、DLD-1 细胞增殖呈剂量依赖性抑制，48 h IC₅₀分别为 53.2±2.3 μg/mL、95.0±5.1 μg/mL，且 HCT 116 对 TES 更敏感。
· 形态变化：显微镜下可见，随 TES 浓度升高，细胞数量减少，HCT 116、DLD-1 细胞从 “梭形间质样” 向 “多边形上皮样” 转变，提示 TES 可能逆转 EMT。
2. TES 对结直肠癌细胞周期与克隆形成的影响
· 周期阻滞：流式细胞术显示，TES 对两种细胞周期阻滞存在差异：
o HCT 116：G0/G1 期细胞比例从 62.8±1.5% 升至 74.1±2.6%（50 μg/mL TES），阻滞于 G0/G1 期；
o DLD-1：S 期细胞比例从 37.6±3.6% 升至 76.1±3.6%（100 μg/mL TES），阻滞于
· 克隆形成抑制：TES 显著降低细胞克隆形成能力，HCT 116 在 12.5 μg/mL TES 时即显抑制效果，DLD-1 在 50 μg/mL 时显效，且浓度越高，克隆数越少（P<0.001）。
3. TES 对结直肠癌细胞迁移与侵袭的抑制作用
· Transwell 实验：与对照组相比，TES 处理 48 h 后：
o 迁移能力：HCT 116（12.5 μg/mL）、DLD-1（25 μg/mL）穿膜细胞数显著减少（P<0.0001）；
o 侵袭能力：铺 Matrigel 后，HCT 116（12.5 μg/mL）、DLD-1（50 μg/mL）跨膜细胞数显著降低（P<0.0001），且呈剂量依赖性。
· 蛋白表达：Western Blot 显示，TES 显著下调迁移侵袭相关蛋白 MMP2、MMP9 表达（HCT 116 中 50 μg/mL TES 时降幅最显著，P<0.001）。
4. TES 对结直肠癌细胞 EMT 的抑制作用
· EMT 标志物：HCT 116 细胞中，TES 剂量依赖性上调上皮标志物 E-Cadherin 表达（50 μg/mL 时较对照组升高 2.3 倍，P<0.001），下调间质标志物 N-Cadherin 及 EMT 转录因子 Snail 表达（50 μg/mL 时分别降低 65%、70%，P<0.001），提示 TES 抑制 EMT 进程。
5. TES 对 Wnt/β-catenin 信号通路的调控作用
· 通路蛋白：HCT 116 细胞中，TES 处理后：
o 上游：Wnt3a（通路配体）表达下调，APC（β-catenin 降解复合物关键蛋白）表达上调；
o 核心：β-catenin（通路开关）表达显著降低（50 μg/mL 时降幅达 72%，P<0.001）；
o 下游：靶基因 c-Myc、Cyclin D1、MMP7 表达均呈剂量依赖性下调（P<0.001），表明 TES 抑制 Wnt/β-catenin 通路激活。
6. TES 在体内的抗结直肠癌作用
· 裸鼠成瘤：给药 20 天后：
o 肿瘤体积：TES 高剂量组（1200 mg/kg）瘤体积为 214.5±56.7 mm³，较模型组（1131.7±267.7 mm³）显著缩小（P<0.001），与 5-FU 组（222.7±100.5 mm³）效果相当；
o 肿瘤重量：TES 高剂量组瘤重 216.9±67.7 mg，抑瘤率 76.4%，接近 5-FU 组（79.2%）；
o 安全性：TES 组裸鼠体重变化与对照组无显著差异，而 5-FU 组体重明显下降（P<0.05）。
· 病理分析：HE 染色显示，模型组肿瘤组织结构清晰、细胞排列整齐；TES 组肿瘤结构紊乱、细胞排列破坏、细胞核固缩，提示 TES 诱导肿瘤细胞损伤。
结论
本研究通过体内外实验证实，桑黄总提取物（TES）对结直肠癌具有显著抑制作用，核心结论如下：
1. 体外：TES 呈剂量依赖性抑制 HCT 116、DLD-1 细胞增殖，通过阻滞 HCT 116 于 G0/G1 期、DLD-1 于 S 期抑制细胞周期，并降低克隆形成能力；同时显著抑制细胞迁移侵袭，下调 MMP2、MMP9 表达。
2. 机制：TES 通过抑制 Wnt/β-catenin 信号通路（下调 Wnt3a、β-catenin，上调 APC，抑制下游 c-Myc/Cyclin D1/MMP7），进而抑制 EMT 进程（上调 E-Cadherin，下调 N-Cadherin/Snail），最终阻止结直肠癌侵袭转移。
3. 体内：TES 在裸鼠皮下瘤模型中显著缩小肿瘤体积、降低瘤重，高剂量组抑瘤率达 76.4%，且安全性优于 5-FU，无明显体重下降。
该研究明确了桑黄抗结直肠癌的关键靶点与通路，为桑黄作为结直肠癌辅助治疗药物的开发提供了实验依据，也为中医药 “多靶点抗肿瘤” 机制研究提供了参考范式。