黑色素瘤作为恶性程度最高的皮肤癌类型，虽仅占皮肤癌发病率的 4%，却贡献了 75% 的皮肤癌死亡率，其转移后临床治疗手段有限，化疗副作用显著、靶向药物受基因型限制，亟需安全高效的新型干预方案。细胞周期失控是黑色素瘤无限增殖的核心特征，若能精准阻断细胞周期进程，即可有效抑制肿瘤生长 —— 其中 G₀/G₁期作为细胞周期起始阶段，是调控细胞增殖的关键节点，成为抗肿瘤研究的重要靶点。
桑黄作为传统药用真菌，其多糖、多酚等活性成分已被证实具有广谱抗肿瘤活性。发表于《蚕业科学》的《桑黄水提物诱导黑色素瘤细胞系 B16-F10 G₀/G₁期阻滞的研究》，通过 MTT 法、流式细胞分析、转录组测序等技术，系统探究桑黄水提物（SH）对黑色素瘤细胞 B16-F10 的抑制作用及机制，首次明确其通过调控 p21-CyclinD3-CDks 信号通路诱导细胞 G₀/G₁期阻滞，为天然药物防治黑色素瘤提供了关键实验依据与新策略。
实验概述
本研究以黑色素瘤细胞系 B16-F10 为体外模型，采用沸水提取法制备桑黄水提物（SH），通过 “浓度 - 时间梯度干预 + 多技术验证” 思路探究其抗肿瘤作用：设置 SH 浓度为 0、50、100、200、400、800 μg/mL，分别处理细胞 24、48、72 h，MTT 法检测增殖抑制率；选取 0、50、200 μg/mL SH 处理 48 h，流式细胞术分析细胞周期（PI 染色）与凋亡（Annexin V-FITC/PI 双染）；通过转录组测序筛选差异表达基因，qRT-PCR 验证细胞周期相关基因（p21、CyclinD3、CDK2 等）表达，Western Blot 检测对应蛋白水平，最终明确 SH 诱导 G₀/G₁期阻滞的分子通路。
实验方法
1. 桑黄水提物（SH）的制备与成分分析
· 提取工艺：取浙江省农业科学院鉴定的瓦宁纤孔菌（Sanghuangporus vaninii）子实体，干燥粉碎后用沸水提取 2 h，离心取上清，冷冻干燥得 SH；每 100 g 子实体得率 184.6 g，苯酚 - 硫酸法测多糖含量 5.51%，福林酚法测多酚含量 23%，HR-ESI-MS 分析显示除多糖外，主要活性成分为核苷酸类与多酚类。
· 溶液配制：将 SH 用含 0.1% DMSO 的无菌水溶解，配制成不同浓度储备液，过滤除菌后备用。
2. 细胞培养与分组干预
· 细胞培养：黑色素瘤细胞 B16-F10 接种于含 10% 胎牛血清、100 μg/mL 青霉素 - 链霉素的 RPMI 1640 培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱，取对数生长期细胞用于实验；
· 分组设计：
o 空白对照组：含 0.1% DMSO 的无菌水处理；
o SH 处理组：分别用 50、100、200、400、800 μg/mL SH 处理；
o 干预时间：24、48、72 h，每组设 3 个重复孔。
3. 核心指标检测
（1）细胞增殖抑制率检测（MTT 法）
· 将 1×10⁴个 B16-F10 细胞 / 孔接种于 96 孔板，培养 24 h 后加不同浓度 SH，继续培养对应时间；
· 弃培养基后加 50 μL 含 1 mg/mL MTT 的培养基，37℃孵育 4 h，加 100 μL DMSO 溶解结晶，酶标仪测 570 nm 处 OD 值，按公式计算抑制率：抑制率 =(1 - 处理组 OD 值 / 对照组 OD 值)×100%。
（2）细胞周期与凋亡分析（流式细胞术）
· 细胞周期检测：1×10⁵个细胞 / 孔接种 6 孔板，0、50、200 μg/mL SH 处理 48 h，收集细胞用 70% 乙醇 4℃固定 12 h，PI 染色 30 min，Cytomics FC 500MCL 流式仪分析 G₀/G₁、S、G₂/M 期细胞比例；
· 细胞凋亡检测：同上处理细胞，Annexin V-FITC（5 μL）与 PI（5 μL）4℃染色 15 min，流式仪区分正常细胞（FITC⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（FITC⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（FITC⁺/PI⁺）、坏死细胞（FITC⁻/PI⁺）。
（3）转录组测序与差异基因分析
· 200 μg/mL SH 处理 48 h 后，收集 1×10⁷个细胞，TRIzol 法提取总 RNA，广州基迪奥公司完成 RNA-seq；
· 用 HISAT2 软件比对基因组，StringTie 组装转录本，以 FPKM 值衡量基因表达，筛选 | fold change|≥2 且 FDR<0.01 的差异表达基因（DEG）；
· GO 富集分析（GOseq R 包）与 KEGG 通路注释（KOBAS 2.0），重点关注 p53 信号通路与细胞周期相关基因。
（4）基因与蛋白表达验证
· qRT-PCR：提取 0、200 μg/mL SH 处理 48 h 的细胞总 RNA，PrimeScript RT 试剂盒反转录为 cDNA，SYBR Fast qPCR Mix 检测基因表达，以 GAPDH 为内参，2⁻ΔΔCt 法计算相对表达量；
· Western Blot：用含蛋白磷酸酶抑制剂的 SD-001 试剂盒提取总蛋白，4%~12% SDS-PAGE 电泳（40 μg / 孔），转 PVDF 膜后 5% BSA 封闭 1 h，一抗（p21、CyclinD3、CDK2、CDK6、β-Actin）4℃孵育过夜，荧光二抗室温孵育 1 h，检测蛋白条带灰度值。
4. 统计分析
采用 SPSS 16.0 软件，数据以表示，多组比较用单因素方差分析，组间两两比较用 t 检验，为差异有统计学意义，为差异极显著；GraphPad Prism 绘制图表。
实验结果
1. 桑黄水提物（SH）抑制 B16-F10 细胞增殖
· 剂量 - 时间依赖性：SH 处理 24 h 后抑制率较低，48 h、72 h 后抑制率显著升高，且随浓度增加而上升；800 μg/mL SH 处理 72 h 时，抑制率超 80%，证实 SH 在体外可强效抑制 B16-F10 细胞增殖。
2. 桑黄水提物诱导 B16-F10 细胞 G₀/G₁期阻滞且不影响凋亡
· 细胞周期变化：与对照组相比，200 μg/mL SH 处理 48 h 后，G₀/G₁期细胞比例显著升高（从 52.3% 升至 78.6%，），S 期细胞比例从 35.1% 降至 16.8%，G₂/M 期无明显变化，表明 SH 特异性诱导 G₀/G₁期阻滞；
· 细胞凋亡结果：Annexin V-FITC/PI 双染显示，各浓度 SH 处理后，早期凋亡（FITC⁺/PI⁻）、晚期凋亡（FITC⁺/PI⁺）及坏死细胞（FITC⁻/PI⁺）比例与对照组无显著差异，说明 SH 抗增殖作用与凋亡无关，仅依赖细胞周期阻滞。
3. 桑黄水提物通过 p21-CyclinD3-CDks 通路调控细胞周期
· 转录组筛选：200 μg/mL SH 处理后，共筛选 2140 个差异表达基因（1059 个上调，1081 个下调），GO 富集于 DNA 修复、细胞周期调控，KEGG 注释显示 p53 信号通路、细胞周期通路显著富集；
· 基因表达验证：qRT-PCR 显示，200 μg/mL SH 处理 48 h 后，p21 mRNA 表达较对照组上调 2.3 倍，CyclinD3、CDK2、CDK6 mRNA 表达分别下调 58%、45%、52%，p53 表达无显著变化；
· 蛋白水平验证：Western Blot 结果与基因表达一致，p21 蛋白表达显著升高，CyclinD3、CDK2、CDK6 蛋白表达显著降低，证实 SH 通过上调 p21、抑制 CyclinD3-CDks 复合体形成，阻断细胞从 G₀/G₁期进入 S 期。
结论
桑黄水提物（SH）对黑色素瘤细胞 B16-F10 的抗增殖作用机制明确，核心路径为p21-CyclinD3-CDks 信号通路介导的 G₀/G₁期阻滞，具体表现为：
1. 增殖抑制效应：SH 以剂量 - 时间依赖性抑制 B16-F10 细胞增殖，800 μg/mL 处理 72 h 抑制率超 80%，体外抗肿瘤活性显著；
2. 细胞周期调控：特异性诱导 G₀/G₁期阻滞，S 期细胞比例降低，且对细胞凋亡无影响，排除凋亡依赖机制；
3. 分子机制：不依赖 p53 信号通路，直接上调 p21 表达，进而抑制 CyclinD3、CDK2、CDK6 的基因与蛋白表达，阻断 CyclinD3-CDks 复合体功能，阻止细胞进入 DNA 合成期。
该研究首次揭示桑黄水提物诱导黑色素瘤细胞 G₀/G₁期阻滞的非 p53 依赖通路，为桑黄在黑色素瘤治疗中的应用提供了分子依据，后续可结合动物模型验证体内疗效，进一步开发天然抗肿瘤药物。